膠體金的簡單介紹

一、膠體金的制備     根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標記探針，其直徑應在3-30nm范圍內(nèi)。     在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應溶液中初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。     以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對一致、直徑3～16nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能夠去除這些殘基。雙標記或制備5-10 nm的膠體金時建議使用該方法。 利用檸檬酸為還原劑，可以制備12～150 nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時，膠體金粒子的誤差也同時增加。因此做單標記時，建議使用該方法制備12-16 nm直徑的膠體金。     除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5 nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。     氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液時一次配完，暫時不用的可以用1.5 ml試管分裝為1 ml保存（-20℃）。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時可硅化處理（1％雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時，烘干）。配制各種試劑時均使用雙蒸水，隨后再用0.22 mm微孔濾膜過濾后使用。三角瓶可反復多次使用，不用時應密封保存，以防污染。     制備好的膠體金保存壽命較長，可4℃保存6個月以上或室溫下保存1-2個月。當出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。但無論無何，在保存較長時間后應進行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金粒子凝集，說明已經(jīng)過期。 1、單寧酸/檸檬酸鈉法制備3～16 nm膠體金 (1)    取一250 ml三角瓶，加入79 ml雙蒸水和1 ml 1％氯化金，預熱至60～70℃。 (2)    取一50 ml燒杯，加入4 ml 1％檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25 mM K2CO3。預熱至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果單寧酸的量少于0.5 ml時，對pH的影響不大，K2CO3可以省略。 (3)    將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。 檸檬酸鈉（ml） 單寧酸（ml） 膠體金（nm） 4 5000 3 4 2000 4 4 500 6 4 120 8 4 70 10 4 10 16 2、白磷還原法制備5 nm膠體金 (1)    取250 ml三角瓶一個，加79 ml雙蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3將溶液調(diào)至中性（pH7.0）。 (2)    取0.2 ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5 ml試管中，再加0.8 ml乙醚，混勻。取0.7 ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作請帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進行中和)。 (3)    室溫下輕輕搖勻15 min，然后加熱沸騰并保持5 min，自然冷卻。 3、檸檬酸三鈉法制備12-30 nm膠體金(Frens, 1973) (1)    取250 ml三角瓶一個，加100 ml雙蒸水及1 ml 1氯化金，加熱沸騰； (2)     檸檬酸鈉(ml) 膠體金(nm) 5 12 4 16 3 24 2.8 30 取不同量的1檸檬酸鈉加入上述溶液中?；靹?，再保持沸騰30 min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，則顏色偏向紫色。 注 意： (1)     由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后進行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。 (2)膠體金溶液好保存在4℃冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個月。但決不可保存在0℃以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。 二、蛋白-金復合體的制備 一般認為膠體金粒子表面為一層AuCl2，因此，粒子表面帶有負電荷，這種負電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。 金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時為中性。由于在pH=pI時蛋白溶解度，因此這時它水化程度小，溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在實際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為pH=PI+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。 膠體金探針所用蛋白要經(jīng)過前處理，其目的在于（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進行。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時與多個膠體金粒子結(jié)合，影響標記的靈敏度和定量分析。（3）使蛋白具有適當?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過?。?0 kD），形成的蛋白復合體往往是不穩(wěn)定，可短時間內(nèi)失活。而分子量過大時，被認為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性的情況下，去除對活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標記靈敏度，延長探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的探針。 當?shù)鞍浊疤幚硗瓿珊?，接著要確定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳pH值。對于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定pH值能夠形成結(jié)合穩(wěn)定的探針。在高濃度電解質(zhì)（如NaCl）作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。一般選擇適宜pH值為佳pH值。但有些探針的實際情況并不完全如此，穩(wěn)定發(fā)探針并不完全代表活性。這要靠實驗驗證。 在確定pH值后，要確定小蛋白量，即能夠形成穩(wěn)定探針的蛋白的小量。如果在制備探針時加入太多的蛋白，不僅造成浪費，而且更為嚴重的是容易造成探針凝聚，并嚴重影響標記活性。因為探針溶液中的游離蛋白容易搶先與標記位點結(jié)合，起到“封閉”（Blocking）作用，而膠體金探針標記不上。在標記位點希少、被標記物含量較少的情況下要特別注意。 這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時，除了蛋白量完全不同外，往往pH也有一定變化。 因此，在探針制備每一環(huán)節(jié)應隨時監(jiān)測探針對分布情況、負染結(jié)合及活性。 1、抗血清的前處理 一般抗血清中IgG的含量為10-25，而絕大部分為其它蛋白。用抗血清直接制備探針其標記活性與特異性均不理想。因此需去除其中多數(shù)雜蛋白。但處理環(huán)節(jié)不宜太繁，在實驗室設(shè)備與經(jīng)驗缺乏的情況下更是如此，否則會導致IgG活性的大幅降低。如果你的實驗室在蛋白純化方面有很強的技術(shù)支持，高度純化后效果會更好。 大量工作表明，只用硫酸銨沉淀就可以足夠純度及高活性的IgG蛋白。其基本步驟如下： (1) 取抗血清0.2 ml； (2) 加生理鹽水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混勻； (3) 逐滴加入飽和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振蕩混勻，4℃靜置1 h； (4) 10000 rpm/min離心20 min，棄上清； (5) 加0.5 ml生理鹽水重懸浮，混勻； (6) 逐滴加0.25 ml飽和 (NH4)2SO4，充分振蕩混勻，4℃靜置1 h； (7) 10000 rpm/min離心20 min，棄上清； (8) 重復5～8步驟一次； (9) 加生理鹽水0.5 ml重懸浮，混勻； (10)生理鹽水中透析12～24 h； (11)在0.2 M pH 9.0硼酸緩沖液透析12～24 h； (12)分裝，即將使用時4℃保存，備用-20℃保存。 為保持抗體活性，整個過程應在4℃下進行。對于凍干抗血清或長時間保存的血清，將生理鹽水透析改為3 M KCNS透析，促使聚合的多聚體解聚。如果抗血清效價較低時，不宜準備膠體金探針。 2、親和純化抗體的處理 親和純化抗體多是一些商品化的通用抗體，即二抗。一般為羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗體。這些抗體一般有兩個問題，一是IgG分子往往聚集為多聚體分子，二是往往含有較多的鹽分。因此前處理的目的在于脫鹽和解聚。 其基本步驟如下： (1) 將親和純化抗體用生理鹽水稀釋為0.5-1 mg/ml濃度 (2) 在3 M KCNS（硫氰酸鉀）溶液中透析12 h (3) 在2 mMol pH 9.0的硼酸緩沖液中透析12 h（更換透析液數(shù)次） (4) 分裝備用 其它蛋白可參考此方法進行。但注意后一種透析液的pH值應與交聯(lián)時pH值一致。在實際運用中，一般省略去3M KCNS透析這一步，特別是當?shù)鞍追肿恿枯^小，且為非糖蛋白時。我們建議在制備通用探針（如二抗IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等時，嚴格使用該方法，而制備直接標記探針時，也可以忽略處理步驟。   3、IgG Fab片段的制備 一般來說體積較小的探針具有相對較高的標記活性。主要原因在于膠體金顆粒較小時有利于在標記溶液中的擴散運動；在膠體金直徑一定時，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位點也越密集，也容易于靶位點結(jié)合。 IgG分子量為150 kD左右，由4個亞基組成，即兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可兩種片段，即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原識別活性的部分，回收后制備探針。Fc能夠與Protein A和Protein G特異性結(jié)合。但這種分離只能在有條件的實驗室進行。 其基本過程如下： (1) 用PBS（pH 7.0，含10 mM EDTA，20 mM鹽酸半胱氨酸）溶解純化的IgG (2) 加固化木瓜蛋白酶 (3) 37℃處理5h (4) 離心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀） (5) 過Protein G柱 (6) 純化的Fab片段按前文方法做進一步處理 注：Fab與膠體金結(jié)合的pH值為6.5 4、蛋白與膠體金結(jié)合pH測定 (例纖維素酶，pI未知) (1) 取若干個1.5ml試管，分別加入1 ml 10 nm膠體金； (2) 用25 mM K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10； (3) 取一96孔培養(yǎng)板，按pH從低到高分別將上述膠體金分別取100 ml加入孔中，重復三次； (4) 每孔分別加入3 ml濃度為1 mg/ml的纖維素酶，混合，室溫下放置10-15 min； (5) 每孔分別加入20 ml濃度為10％ NaCl溶液，混合，室溫下放置10 min； (6) 觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的pH(X)； (7) 重復(1)-(5)步，pH梯度為X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。 (8) 觀察膠體金顏色變化直到室溫下放置2小時，記錄仍保持紅色的pH。  注意： 1．如膠體金粒子直徑較小（3～6nm），加NaCl需放置較長時間（幾個甚至十幾個小時）后才能觀察到顏色變化。必要時可放大反應體積（1 ml膠體金），并借助離心來判斷。 2．有些蛋白pH范圍較窄，設(shè)置的梯度不能太大。 5、蛋白濃度的確定 (1) 用0.22 mm微孔濾膜過濾或高速離心去除蛋白中殘物或多聚體； (2) 取一96孔滴定板，每個重復為若干個孔，分別加入pH的膠體金100 ml，重復3次； (3) 各孔依次加入不同量的蛋白（一般濃度為0.05-0.1 mg/ml）1～20 ml，混勻，室溫下放置15min； (4) 加入20 ml 10％ NaCl，室溫下放置10min； (5) 顏色仍保持紅色的蛋白用量即蛋白濃度。 (6) 為確保結(jié)果準確性，可放大反應體積重復以上步驟。 注：在實際探針制備工作中，蛋白濃度往往為濃度的130％。  6、IgG-gold的制備 (1) 取兩個1.5 ml試管，分別加入1.2 ml 10 nm膠體金； (2) 加入適量25 mM K2CO3把pH調(diào)整為9.0； (3) 分別加入10 ml濃度為1 mg/ml IgG，混勻，室溫放置10min； (4) 分別加入12 ml 2 PEG20000，室溫放置5 min； (5) 10000 rpm離心20 min，輕輕吸除上清； (6) 用20 ml BL溶液重懸浮松散的膠體金沉淀，并集中到新管中； (7) 分別加20 ml 甘油，充分混勻； (8) -20℃保存?zhèn)溆谩?注意： 1).不同直徑膠體金所需要的蛋白量差別很大； 2).不同直徑膠體金所需離心速度完全不同。以絕大部分探針形成松散沉淀為原則。離心力太大，會產(chǎn)生不可逆的探針凝聚；離心力太小，探針無法沉下。好能夠直接用膠體金在不同轉(zhuǎn)速下離心以確定適當?shù)碾x心力。 3).在冷離心機中可適當延長離心時間，同時適當減小離心力，探針活性較好。 4).IgG的交聯(lián)pH有多種報導，從7.4-9.0。一般認為，7.4時膠體金結(jié)合的蛋白多，9.0時制備的探針穩(wěn)定。 三、樣品的固定、包埋與標記 1．固定 為了減少對標記底物結(jié)構(gòu)的破壞，細胞化學樣品固定的時間相對較短，多為1-3小時。環(huán)境溫度一般在25°C以下。 低溫固定劑一般采用2-3甲醛與1戊二醛。甲醛分子量小、滲透快，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，可較好地保存其抗原活性。但對細胞整體的細微結(jié)構(gòu)保存欠佳。戊二醛對細胞的細微結(jié)構(gòu)保存較好，但往往導致蛋白失去抗原活性。因此，在標記低物不是蛋白質(zhì)或多肽時（如纖維素、多酚類化合物、b-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)等），可用常規(guī)方法進行4戊二醛和1鋨酸的雙固定。 2．包埋 根據(jù)標記低物的不同，可以選擇常規(guī)（常溫）包埋劑或低溫包埋劑包埋樣品。如果標記物為蛋白質(zhì)，特別是性質(zhì)不穩(wěn)定或不清楚時，建議使用低溫包埋劑包埋，以保存抗原活性。大量實驗表明，K4M是目前使用普遍的低溫包埋劑。當選擇常溫包埋劑時，建議使用Spurr包埋劑。Spurr包埋劑粘性小，易滲透，易操作；包埋塊不吸潮，保存時間長。 3．標記 根據(jù)標記程序的不同，標記分直接與間接標記。直接標記指膠體金探針直接與被標記底物結(jié)合；而間接標記指膠體金探針通過一或多個中間標記物后與底物結(jié)合。 直接標記需要制備膠體金探針，其好處是標記特異性好，背景小，能夠做陰性對照。間接標記無需制備膠體金探針，可以直接購買通用二抗探針，缺點是標記特異性較難把握，背景較高，不能夠做陰性對照。 <p class="MsoNorma 直接標記、間接標記 相關(guān)文章：膠體金試紙條原理；免疫膠體金技術(shù) 歡迎致電：021-68413769